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tm值与退火温度

1.一般来说,较低的退火温度可以提高pcr反应的敏感性但特异性较差;而较高的退火温度则可以提高pcr的特异性但却降低了扩增效率。通常引物与模板的退火温度在45-55度。 2.优化退火温度最好的方法是设置一系列对照反应,即通过在低于计算出的引物T...

我用primer 5设计出来的Tm值从来都是直接当退火温度用。用引物primer-blast的话我都是直接贴序列上去。有其他菌的匹配很正常,有些进化亲缘性很近的,只要在同一物种中没有匹配上的问题应该不大!

不同的PCR MIX所设置的退火温度是不一样的,有的比最低Tm值低5℃,有的低3℃,请你参考你所买的PCR MIX的说明书,上面肯定有详细说明。 一般PCR比最低Tm值低1-5℃,都没什么问题。 RT-PCR的文献上,有推荐的设计软件,也有推荐的PCR MIX,跟着说明...

PCR包括3步,变性,退火,延伸。退火温度一般根据引物TM值确定

加热使DNA双螺旋解开,在一定的条件下,两条互补的单链依靠彼此的碱基配对重新形成双链DNA的过程,亦即复性过程。热变性的DNA单链在缓慢冷却过程中可以达到很好的退火。退火的两条单链可以来自同一个双链的DNA分子,也可以来自不同的DNA分子。退...

根据引物的Tm值,在附近5~10度做一个退火温度的梯度吧!大部分的PCR仪器都有这一功能! PCR仪器在一排(12个孔)或一列(8个孔)中每个孔的温度都不同,你在相应的孔中放入待反应的PCR混合液(保证每孔中反应液一致),记录相应的温度,PCR产物经琼脂...

退火温度越低,引物和底物越容易结合,错配情况增多,造成PCR特异性降低,产物混入预期外片段。

Tm指的是把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。 我们PCR时候,当然不能用Tm值来作为退火的温度。一般来说,退火温度比Tm值要低上5度左右。但是这个也不是绝对的。建议你如果说模板比较充足的话,做一个梯度试验。

tm是50%解链,那么退火要复性,必然不能只有一半的DNA复性,所以温度低一点,就能使引物充分与模板链结合了。

预变性 模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟. 变性步骤 循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可 缩短该步骤时间 变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易...

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